RAA等溫擴(kuò)增技術(shù)作為分子檢測領(lǐng)域的新產(chǎn)物，突破了傳統(tǒng)PCR對熱循環(huán)儀的依賴，可在37-42℃恒溫條件下實現(xiàn)靶標(biāo)DNA/RNA的快速擴(kuò)增，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場快檢、基層醫(yī)療與應(yīng)急防疫。
RAA等溫擴(kuò)增的高靈敏度與便捷性，要求使用者掌握嚴(yán)謹(jǐn)、規(guī)范的操作流程，以避免污染、假陰性或結(jié)果漂移。
第一步：環(huán)境準(zhǔn)備與試劑預(yù)平衡
在獨(dú)立的核酸操作區(qū)進(jìn)行，遵循“三區(qū)分離”原則（試劑準(zhǔn)備、樣本處理、擴(kuò)增檢測）。從-20℃冰箱取出RAA試劑盒，置于冰上緩慢解凍。使用前將所有組分（引物探針、緩沖液、酶混合液）短暫離心，確保管壁無殘留。工作臺面用75%乙醇或DNAAway清潔，開啟生物安全柜并紫外照射15分鐘。
第二步：反應(yīng)體系配制
按說明書比例在無菌PCR管中加入：
RAA緩沖液（含dNTPs、Mg??）；
上下游引物與熒光探針（FAM/TAMRA標(biāo)記）；
RAA酶混合液（含重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合酶）；
無核酸酶水補(bǔ)足體積。
每批次設(shè)陽性對照與陰性對照（用水代替模板），防止假陰性或污染誤判。
第三步：模板加入與混勻
將提取好的DNA/RNA模板（通常1-2μL）加入反應(yīng)管，輕彈混勻，短暫離心。注意更換槍頭，避免交叉污染。若檢測RNA，需先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶處理為cDNA，或使用RT-RAA一步法試劑盒。
第四步：恒溫擴(kuò)增
將反應(yīng)管放入預(yù)熱至39±1℃的干式恒溫儀或水浴鍋中，蓋緊蓋子防止冷凝水進(jìn)入。擴(kuò)增時間通常為10-20分鐘。部分封閉式設(shè)備可實時監(jiān)測熒光信號，實現(xiàn)定量分析。
第五步：結(jié)果判讀
擴(kuò)增結(jié)束后，立即讀取熒光信號：
熒光法：FAM通道熒光值超過閾值線且呈S型上升曲線為陽性；
試紙條法：取擴(kuò)增產(chǎn)物滴加側(cè)向流試紙條，出現(xiàn)T線與C線為陽性。陰性對照應(yīng)無信號，陽性對照應(yīng)有效擴(kuò)增，否則實驗無效。
第六步：廢棄物處理與記錄
所有耗材（槍頭、離心管）按生物危險廢物處理，高壓滅菌后丟棄。填寫實驗記錄，包括樣本編號、試劑批號、儀器參數(shù)、結(jié)果與操作人員。
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